预包被酶标板表面除了共价结合的捕获抗体，还有大量未反应的聚苯乙烯疏水表面。如果不封闭，检测抗体和酶结合物会非特异性吸附在这些位点上，导致所有孔OD值整体偏高，信噪比骤降。
最经典的封闭液是1%-5%牛血清白蛋白（BSA）或5%脱脂奶粉溶于PBS。脱脂奶粉便宜，但含有生物素和生物素结合蛋白，若实验体系使用生物素-亲和素放大，奶粉会产生强烈背景，此时必须用BSA。
商用试剂盒通常提供现成的封闭液或样本稀释液，不要自行更换成分。若需要自行封闭，推荐配方：1%BSA+0.05%吐温20的PBS溶液，37℃封闭1小时或4℃封闭过夜。封闭后甩干，不洗，直接加入样本。
封闭时间过长（超过24小时）并不好，会使包被抗体从板上解离。有些试剂盒采用"不封闭"设计，直接在样本稀释液中加入BSA起到原位封闭作用，这种情况下额外封闭反而会降低信号。
出现背景偏高时排查顺序：先看洗板是否充分，再看封闭液是否过期，最后看底物是否被光照变质。TMB底物对光极敏感，储存管应包裹铝箔，工作液配制后15分钟内使用。若底物变蓝紫色，说明已被污染或氧化，整瓶丢弃。